این کیت برای استخراج همزمان RNA و DNA ویروسی با حساسیت و اختصاصیت بالا از طیف گسترده‌ای از نمونه‌های مایعات بدن نظیر خون، سرم، پالسما، مایعات بدن و همچنین بافت دهانه رحم (نمونه‌های Liquid-Based) طراحی و بهینه‌سازی شده است.

بله. این کیت به‌طور ویژه برای خالص‌سازی همزمان RNA و DNA ویروسی از نمونه‌های بالینی طراحی شده است. نوکلئیک اسیدهای استخراج‌شده با این کیت برای کاربردهای مولکولی نظیر PCR و Real-Time PCR مناسب می‌باشند.

ستون‌ها و تمامی بافرها در دمای اتاق (۱۸ تا ۲۵ درجه سانتی‌گراد) تا پایان تاریخ انقضا پایدار هستند. تأکید می‌شود که نگهداری بافرها در یخچال (۲-۸ درجه) یا فریزر (۱۵- تا ۲۵- درجه) به دلیل تشکیل رسوب، تأثیر منفی بر عملکرد کیت خواهد داشت. پروتئیناز K و NA Carrier پس از آماده‌سازی باید در دمای ۲۰- درجه سانتی‌گراد نگهداری شوند.

• پروتئیناز K: به ازای هر ویال ۴ میلی‌گرمی، مقدار ۲۰۰ میکرولیتر از بافر PK اضافه شده و به مدت ۲۰ ثانیه ورتکس می‌گردد. آنزیم پس از آماده‌سازی باید در دمای ۲۰- درجه سانتی‌گراد نگهداری شود.

• NA Carrier: میزان ۳۲۰ میکرولیتر بافر VEB به تیوب حاوی ۳۲۰ میکروگرم Carrier NA لیوفیلیزه اضافه شده و کاملاً همگن می‌گردد. به ازای هر نمونه، میزان ۳ میکرولیتر از محلول Carrier NA به ۲۰۰ میکرولیتر بافر DL اضافه می‌شود.

سایر بافرهای این کیت آماده مصرف می‌باشند.

حجم استاندارد نمونه برای استخراج، ۲۰۰ میکرولیتر می‌باشد. استفاده از حجم کمتر از ۲۰۰ میکرولیتر توصیه نمی‌شود. در صورت در دسترس بودن حجم کمتر، می‌توان با افزودن بافر PBS حجم نمونه را به ۲۰۰ میکرولیتر رساند. برای نمونه‌های Liquid-Based، ابتدا مرحله تغلیظ با سانتریفیوژ انجام شده و سپس رسوب سلولی برای استخراج استفاده می‌گردد.

NA Carrier (حامل اسید نوکلئیک) یک ترکیب کمکی است که به منظور افزایش بازده استخراج اسیدهای نوکلئیک از نمونه‌هایی با بار ویروسی پایین به بافر DL اضافه می‌شود. این ماده به عنوان حامل عمل کرده و با اتصال به اسیدهای نوکلئیک هدف (RNA و DNA ویروسی)، میزان بازیابی آنها را به طور قابل‌توجهی افزایش می‌دهد. استفاده از NA Carrier به ویژه در استخراج از نمونه‌های با تیتر ویروسی پایین ضروری می‌باشد.

حجم استاندارد بافر VEB برای الوشن، ۶۰ میکرولیتر می‌باشد. استفاده از حجم کمتر از ۶۰ میکرولیتر باعث افزایش غلظت نوکلئیک اسید در مایع عبوری می‌شود، اما میزان کل نوکلئیک اسید استخراج‌شده را اندکی کاهش می‌دهد. توصیه می‌شود بافر VEB قبل از استفاده در دمای ۶۰ درجه سانتی‌گراد گرم شده و ستون به مدت حداقل ۱ دقیقه در دمای اتاق انکوبه گردد. افزایش زمان انکوباسیون تا بیش از ۵ دقیقه باعث افزایش بازده استخراج می‌شود.

بله. راهکارهای زیر باعث افزایش بازده استخراج نوکلئیک اسید می‌شود:

• افزایش زمان انکوباسیون با بافر VEB بیش از ۵ دقیقه قبل از سانتریفیوژ

• انکوبه کردن ستون با درب بسته در دمای ۶۰ درجه سانتی‌گراد

• تکرار مرحله الوشن با بافر VEB رد شده از ستون برای بار دوم که باعث افزایش ۲۰ تا ۵۰ درصدی میزان نوکلئیک اسید استخراجی می‌گردد

• نمونه‌های مایعات بدن (خون، سرم، پالسما): نمونه مستقیماً با بافر DL و پروتئیناز K ترکیب شده و پس از انکوباسیون در دمای ۵۶ درجه، اتانول اضافه شده و به ستون منتقل می‌شود.

• نمونه‌های Liquid-Based (بافت دهانه رحم): ابتدا نمونه با سانتریفیوژ تغلیظ شده و رسوب سلولی جدا می‌گردد. سپس رسوب با بافر TL و پروتئیناز K الیز شده و پس از انکوباسیون، بافر DL و اتانول اضافه می‌شود. این روش حساسیت بالایی برای استخراج DNA ویروس HPV دارد.

دلایل اصلی کاهش غلظت و راهکارهای مربوطه عبارتند از:

• کافی نبودن نمونه: استفاده از حجم نمونه بیشتر و رعایت اصول صحیح نمونه‌برداری

• الیز نامناسب: رعایت زمان انکوباسیون ۱۰ دقیقه با بافر DL در دمای ۵۶ درجه و مخلوط کردن کامل نمونه با ورتکس

• عملکرد نامناسب پروتئیناز K: اطمینان از نگهداری در دمای ۲۰- درجه و آماده‌سازی مجدد

• نگهداری نمونه در شرایط نامناسب: خودداری از استفاده از نمونه‌های با چرخه انجماد-ذوب مکرر

• عبور نکردن کامل محلول از ستون: افزایش زمان یا سرعت سانتریفیوژ و حذف رسوب قبل از انتقال به ستون

• تخریب RNA: به حداقل رساندن آلودگی RNase محیطی و استفاده از نمونه تازه

• مسدود شدن غشاء ستون: خودداری از استفاده از بافرهای دارای رسوب و رعایت حجم مجاز نمونه