این کیت برای استخراج همزمان RNA و DNA ویروسی با بازدهی بالا از طیف گسترده‌ای از نمونه‌ها طراحی شده است که شامل مایعات بدن (خون، سرم، پالسما)، سوسپانسیون‌های سلولی، نمونه‌های Liquid-Based (بافت دهانه رحم)، نمونه مدفوع، سوآپ‌های چشمی، بینی و حلق، خلط (Sputum)، BAL و مایع مغزی-نخاعی (CSF) می‌باشد.

بله. این کیت به‌طور ویژه برای خالص‌سازی همزمان RNA و DNA ویروسی از نمونه‌های بالینی طراحی شده است. نوکلئیک اسیدهای استخراج‌شده با این کیت قابل برش توسط آنزیم‌های محدودکننده بوده و برای کاربردهای مولکولی نظیر PCR و Southern Blot مناسب می‌باشند.

• پروتئیناز K: به ازای هر ویال ۴ میلی‌گرمی، مقدار ۲۰۰ میکرولیتر از بافر PK اضافه شده و به مدت ۲۰ ثانیه ورتکس می‌گردد. آنزیم پس از آماده‌سازی باید در دمای ۲۰- درجه سانتی‌گراد نگهداری شود.

• NA Carrier: میزان ۳۲۰ میکرولیتر بافر VEB به تیوب حاوی ۳۲۰ میکروگرم Carrier NA لیوفیلیزه اضافه شده و کاملاً همگن می‌گردد. به ازای هر نمونه، میزان ۳ میکرولیتر از محلول Carrier NA به ۵۰۰ میکرولیتر بافر LB اضافه می‌شود.

سایر بافرهای این کیت آماده مصرف می‌باشند.

حجم استاندارد نمونه برای استخراج از مایعات بدن، ۵۰۰ میکرولیتر می‌باشد. استفاده از حجم کمتر از ۵۰۰ میکرولیتر توصیه نمی‌شود. در صورت در دسترس بودن حجم کمتر، می‌توان با افزودن بافر PBS حجم نمونه را به ۵۰۰ میکرولیتر رساند. برای نمونه‌های Liquid-Based، ابتدا مرحله تغلیظ با سانتریفیوژ انجام شده و سپس رسوب سلولی برای استخراج استفاده می‌گردد.

NA Carrier (حامل اسید نوکلئیک) یک ترکیب کمکی است که به منظور افزایش بازده استخراج اسیدهای نوکلئیک از نمونه‌هایی با بار ویروسی پایین به بافر LB اضافه می‌شود. این ماده به عنوان حامل عمل کرده و با اتصال به اسیدهای نوکلئیک هدف (RNA و DNA ویروسی)، میزان بازیابی آنها را به طور قابل‌توجهی افزایش می‌دهد. استفاده از NA Carrier به ویژه در استخراج از نمونه‌های با تیتر ویروسی پایین ضروری می‌باشد.

حجم استاندارد بافر VEB برای الوشن، ۶۰ میکرولیتر می‌باشد. استفاده از حجم کمتر از ۶۰ میکرولیتر باعث افزایش غلظت نوکلئیک اسید در مایع عبوری می‌شود، اما میزان کل نوکلئیک اسید استخراج‌شده را اندکی کاهش می‌دهد. توصیه می‌شود بافر VEB قبل از استفاده در دمای ۶۰ درجه سانتی‌گراد گرم شده و ستون به مدت حداقل ۱ دقیقه در دمای اتاق انکوبه گردد. افزایش زمان انکوباسیون تا بیش از ۵ دقیقه و انکوبه کردن ستون با درب بسته در دمای ۶۰ درجه باعث افزایش بازده استخراج می‌شود.

بله. راهکارهای زیر باعث افزایش بازده استخراج نوکلئیک اسید می‌شود:

• افزایش زمان انکوباسیون با بافر VEB بیش از ۵ دقیقه قبل از سانتریفیوژ

• انکوبه کردن ستون با درب بسته در دمای ۶۰ درجه سانتی‌گراد

• تکرار مرحله الوشن با بافر VEB رد شده از ستون برای بار دوم که باعث افزایش ۲۰ تا ۵۰ درصدی میزان نوکلئیک اسید استخراجی می‌گردد

• مایعات بدن و سوسپانسیون‌ها: نمونه مستقیماً با بافر LB و پروتئیناز K ترکیب شده و پس از انکوباسیون در دمای ۵۶ درجه، اتانول اضافه شده و به ستون منتقل می‌شود.

• نمونه مدفوع: ابتدا نمونه در محلول سالین ۰.۹٪ حل شده، سانتریفیوژ و سپس فیلتراسیون با فیلتر ۰.۲۲ میکرومتری انجام می‌شود. سپس فرایند مشابه مایعات بدن ادامه می‌یابد.

• نمونه سوآپ: سوآپ در بافر PBS حاوی ترکیبات ضد قارچ انکوبه شده و سپس حجم نمونه تغلیظ می‌گردد.

• نمونه‌های Liquid-Based: نمونه با سانتریفیوژ تغلیظ شده، رسوب با بافر TL و پروتئیناز K الیز شده و سپس بافر LB و اتانول اضافه می‌شود.

دلایل اصلی کاهش غلظت و راهکارهای مربوطه عبارتند از:

• کافی نبودن نمونه: استفاده از حجم نمونه بیشتر و رعایت اصول صحیح نمونه‌برداری

• الیز نامناسب: رعایت زمان انکوباسیون ۱۰ دقیقه با بافر LB در دمای ۵۶ درجه و مخلوط کردن کامل نمونه با ورتکس

• عملکرد نامناسب پروتئیناز K: اطمینان از نگهداری در دمای ۲۰- درجه و آماده‌سازی مجدد

• نگهداری نمونه در شرایط نامناسب: خودداری از استفاده از نمونه‌های با چرخه انجماد-ذوب مکرر

• عبور نکردن کامل محلول از ستون: افزایش زمان یا سرعت سانتریفیوژ و حذف رسوب قبل از انتقال به ستون

• تخریب RNA: به حداقل رساندن آلودگی RNase محیطی و استفاده از نمونه تازه

• مسدود شدن غشاء ستون: خودداری از استفاده از بافرهای دارای رسوب و رعایت حجم مجاز نمونه