تکنیک استخراج RNA چیست؟

RNA یا ریبونوکلئیک اسید یکی از اسیدهای نوکلئیک مهم در سلول‌ها است که در فرآیند بیان ژن، ترجمه پروتئین و تنظیم مسیرهای سلولی نقش دارد. استخراج RNA یک مرحله ضروری در بسیاری از مطالعات ژنتیکی و بیولوژی مولکولی، از جمله Real-Time PCR، RNA-Seq، مطالعات ترانسکریپتومیکس و بیوتکنولوژی محسوب می‌شود.

بر خلاف DNA، RNA ساختاری ناپایدارتر دارد و به‌راحتی توسط آنزیم‌های RNase تجزیه می‌شود. به همین دلیل، استخراج RNA نیاز به دقت بالا، شرایط استریل و استفاده از مواد مهارکننده RNase دارد.

در این مقاله، علاوه بر بررسی فرآیند استخراج RNA، به روش‌های مختلف، مزایا و معایب آنها، پروتکل استاندارد استخراج و کاربردهای این تکنیک در تحقیقات زیستی و پزشکی پرداخته خواهد شد.

هدف از استخراج RNA

استخراج RNA برای طیف وسیعی از کاربردهای تحقیقاتی و تشخیصی انجام می‌شود، از جمله:

• بیان ژن و مطالعات ترانسکریپتومیکس: بررسی میزان بیان ژن‌ها در شرایط مختلف با استفاده از Real-Time PCR یا RNA-Seq.
• مطالعات ژنتیک پزشکی و تشخیص بیماری‌ها: شناسایی بیومارکرهای RNA در بیماری‌هایی مانند سرطان و عفونت‌های ویروسی (مانند کووید-۱۹).
• تحقیقات زیست‌شناسی سلولی: بررسی نقش miRNAها و siRNAها در تنظیم بیان ژن.
• بیوتکنولوژی و تولید داروهای زیستی: استفاده از RNA در مهندسی ژنتیک و تولید واکسن‌های RNA مانند واکسن‌های mRNA کرونا
• تشخیص ویروس‌ها: شناسایی RNA ویروسی در نمونه‌های بالینی مانند SARS-CoV-2 با استفاده از تکنیک‌های RT-PCR.

مراحل استخراج RNA

1. لیز سلولی و جلوگیری از تخریب RNA
   برای شکستن غشای سلول و آزادسازی RNA، از بافرهای حاوی گوانیدین و ایزوتیوسیانات استفاده می‌شود که RNaseها را غیرفعال کرده و از تخریب RNA جلوگیری می‌کند.
2. حذف DNA و پروتئین‌ها
   برای حذف DNA، از آنزیم DNase استفاده می‌شود. چربی‌ها و پروتئین‌ها با استفاده از فنل-کلروفرم یا فیلترهای سیلیکایی حذف می‌شوند.
3. رسوب‌دهی و شست‌وشو
   RNA با اتانول ۷۰ درصد رسوب داده شده و با شست‌وشوی مناسب، ناخالصی‌ها حذف می‌شوند.
4. حل‌سازی و ذخیره‌سازی
   RNA استخراج‌شده در آب بدون RNase یا بافر TE حل شده و در دمای -۸۰ درجه سانتی‌گراد نگهداری می‌شود.

روش‌های استخراج RNA

1. روش فنل-کلروفرم (Trizol Method)

در این روش، RNA از DNA و پروتئین‌ها با استفاده از ترکیبات آلی مانند فنل، کلروفرم و ایزوپروپانول جدا می‌شود. این روش حساسیت بالایی دارد اما کار با آن نیازمند دقت بالا و رعایت شرایط استریل است.
مزایا:
✔ استخراج RNA با خلوص بالا
✔ امکان استخراج همزمان DNA و پروتئین از یک نمونه
✔ مناسب برای طیف وسیعی از نمونه‌ها (خون، بافت، سلول، ویروس)
معایب:
✘ استفاده از مواد شیمیایی سمی (فنل و کلروفرم)
✘ فرآیند نسبتاً طولانی و نیازمند دقت بالا

۲٫ روش ستونی (Silica Column-Based)

در این روش، RNA به فیلترهای سیلیکایی متصل شده و پس از شست‌وشو، RNA خالص استخراج می‌شود. این روش برای آزمایش‌های حساس مانند RT-PCR و NGS ایده‌آل است.
مزایا:
✔ روش سریع و ایمن
✔ کاهش خطر آلودگی به RNase
✔ مناسب برای کاربردهای حساس مانند qRT-PCR و RNA-Seq
معایب:
✘ هزینه بالاتر نسبت به روش TRIzol
✘ ظرفیت محدود برای نمونه‌های با حجم بالا

۳٫ روش مغناطیسی (Magnetic Bead-Based)

در این روش، ذرات مغناطیسی به RNA متصل شده و با اعمال میدان مغناطیسی از محلول جدا می‌شوند.

مزایا:
✔ دقت و کارایی بالا
✔ مناسب برای استخراج RNA از نمونه‌های پیچیده
✔ قابلیت اتوماسیون در آزمایشگاه‌های بالینی و تحقیقاتی

معایب:
✘ هزینه بالاتر نسبت به سایر روش‌ها
✘ نیاز به تجهیزات خاص برای کار با ذرات مغناطیسی

• بیشتر بخوانید: استخراج DNA چیست؟

پروتکل استاندارد استخراج RNA

مواد و تجهیزات مورد نیاز:

• TRIzol یا بافر لیزکننده مخصوص RNA
• کلروفرم
• اتانول ۹۶٪ و ۷۰٪
• آنزیم DNase برای حذف DNA ژنومی
• بافر TE یا آب RNase-Free
• سانتریفیوژ، میکروپیپت، انکوباتور، هود استریل

مراحل انجام کار:

• لیز سلولی: نمونه را با TRIzol یا بافر مخصوص RNA مخلوط کرده و انکوبه کنید.
• جداسازی فازها: کلروفرم اضافه کرده، سانتریفیوژ کنید و فاز آبی حاوی RNA را جدا کنید.
• رسوب‌دهی: به فاز آبی، اتانول سرد یا ایزوپروپانول اضافه کنید و سانتریفیوژ کنید تا RNA رسوب کند.
• شست‌وشو: RNA با اتانول ۷۰٪ بشویید و مجدداً سانتریفیوژ کنید.
• حل‌سازی: RNA را در آب RNase-Free یا DEPC-treated حل کرده و در دمای مناسب ذخیره کنید.

استخراج RNA با کیت‌های به ژن

شرکت به ژن کیت‌های استاندارد و کارآمدی را برای استخراج RNA طراحی کرده است که در آزمایش‌های تحقیقاتی و تشخیصی مورد استفاده قرار می‌گیرند. ویژگی‌های کیت‌های استخراج RNA به ژن عبارتند از:

• استخراج RNA خالص و بدون آلودگی DNA
• سریع و کارآمد برای کاربردهای تشخیصی و تحقیقاتی
• سازگار با انواع نمونه‌ها از جمله خون، بافت و ویروس
• حفظ کیفیت RNA برای آزمایش‌های حساس

نتیجه‌گیری

استخراج RNA فرآیندی حیاتی برای مطالعات مولکولی و تشخیصی است. استفاده از کیت‌های استاندارد ما تضمین‌کننده کیفیت، دقت و سرعت بالا در استخراج RNA برای آزمایشگاه‌های تحقیقاتی و پزشکی است.