این کیت به‌طور ویژه برای استخراج DNA از بافت‌های تثبیت‌شده در فرمالین و پارافینه (FFPE) طراحی و بهینه‌سازی شده است. نمونه‌های بافت FFPE شامل بافت‌های جراحی شده انسانی می‌باشند که به عنوان یک روش رایج جهت حفظ و بایگانی نمونه‌های بافتی مورد استفاده قرار می‌گیرند.

خیر. یکی از مزایای اصلی این کیت، انجام فرایند پارافین‌زدایی (Deparaffinization) بدون نیاز به مواد شیمیایی سمی نظیر زایلن می‌باشد. بافر Deparaffinization Solution که در کیت ارائه شده است، این امکان را فراهم می‌آورد.

میزان DNA استخراج‌شده به حجم و نوع بافت مورد استفاده بستگی دارد. به طور کلی از ۱۰ تا ۳۰ میلی‌گرم بافت پارافینه، مقدار ۶ تا ۱۲ میکروگرم (µg) DNA با نسبت جذب A260/A280 در محدوده ۱.۸ تا ۱.۹ (نشان‌دهنده خلوص بالا) قابل استحصال می‌باشد. طول DNA استخراج‌شده معمولاً بیش از ۶۵۰ جفت‌باز (bp) است.

این کیت دارای مزایای زیر می‌باشد:

• پارافین‌زدایی بدون نیاز به زایلن (ایمن‌تر و سازگار با محیط زیست)

• عدم نیاز به انکوباسیون overnight (شب‌گذاری) برای الیز نمونه

• بهینه‌سازی شرایط الیز برای مقابله با چالش‌های ناشی از Cross-Link پروتئین‌ها و اسیدهای نوکلئیک در اثر تثبیت با فرمالین

• استخراج DNA با کیفیت بالا مناسب برای کاربردهای مولکولی حساس

ستون‌ها و تمامی بافرها در دمای اتاق (۱۸ تا ۲۵ درجه سانتی‌گراد) تا پایان تاریخ انقضا پایدار هستند. تأکید می‌شود که نگهداری بافرها در یخچال (۲-۸ درجه) یا فریزر (۱۵- تا ۲۵- درجه) به دلیل تشکیل رسوب، تأثیر منفی بر عملکرد کیت خواهد داشت. پروتئیناز K پس از آماده‌سازی باید در دمای ۲۰- درجه سانتی‌گراد نگهداری شود.

• پروتئیناز K: به ازای هر ویال ۴ میلی‌گرمی، مقدار ۲۰۰ میکرولیتر از بافر PK اضافه شده و به مدت ۲۰ ثانیه ورتکس می‌گردد.

• بافر Binding: به ازای هر ۴ میلی‌لیتر بافر Binding، مقدار ۷ میلی‌لیتر اتانول ۹۶ یا ۱۰۰ درصد اضافه شده و پس از بستن درب، به مدت ۲۰ ثانیه به خوبی مخلوط می‌شود.

سایر بافرهای این کیت آماده مصرف می‌باشند.

حجم استاندارد بافر EB برای الوشن، ۷۰ میکرولیتر می‌باشد. استفاده از حجم کمتر از ۷۰ میکرولیتر باعث افزایش غلظت DNA در مایع عبوری می‌شود، اما میزان کل DNA استخراج‌شده را کمی کاهش می‌دهد. شستشوی غشاء با حجم کمتر از ۵۰ میکرولیتر بافر EB توصیه نمی‌شود، زیرا باعث کاهش قابل‌توجه میزان DNA استخراج‌شده می‌گردد.

بله. راهکارهای زیر باعث افزایش بازده استخراج DNA می‌شود:

• افزایش زمان انکوباسیون با بافر EB بیش از ۵ دقیقه قبل از سانتریفیوژ

• انکوبه کردن ستون با درب بسته در دمای ۶۰ درجه سانتی‌گراد

• تکرار مرحله الوشن با بافر EB رد شده از ستون برای بار دوم که باعث افزایش ۲۰ تا ۵۰ درصدی میزان DNA استخراجی می‌گردد

دلایل اصلی کاهش غلظت و راهکارهای مربوطه عبارتند از:

• کافی نبودن نمونه: جدا کردن پارافین اضافی با تیغ استریل و استفاده از حجم نمونه بیشتر

• الیز نامناسب: افزایش زمان انکوباسیون با بافر TL تا ۳ ساعت یا انکوباسیون overnight

• عبور نکردن کامل محلول از ستون: افزایش زمان یا سرعت سانتریفیوژ و حذف رسوب قبل از انتقال به ستون

• عملکرد نامناسب پروتئیناز K: اطمینان از نگهداری در دمای ۲۰- درجه و آماده‌سازی مجدد

DNA استخراج‌شده با این کیت از کیفیت و خلوص بالایی برخوردار بوده و برای کاربردهای حساس مولکولی نظیر واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR)، توالی‌یابی (Sequencing)، آنالیز STR (برای شناسایی ژنتیکی) و سایر آزمایش‌های تشخیصی مولکولی مناسب می‌باشد.

بله. برای بافت‌های پارافینه، مرحله پارافین‌زدایی با بافر Deparaffinization Solution در دمای ۸۰ درجه انجام می‌شود. برای بافت‌های فرمالینه (بدون پارافین)، به جای آن، مراحل آب‌گیری مجدد (Rehydration) با اتانول ۱۰۰٪، ۷۰٪ و ۵۰٪ انجام می‌گیرد. هر دو روش در نهایت به مرحله الیز با بافر TL و پروتئیناز K ختم می‌شوند.