این کیت برای استخراج DNA ژنومیک قارچ‌هایی نظیر گونه‌های آسپرژیلوس و کاندیدا از خون محیطی، نمونه BAL، مایع مغزی-نخاعی (CSF)، نمونه مایع چشمی، خلط و محیط کشت قارچ طراحی شده است. همچنین برای استخراج ژنوم باکتری‌هایی نظیر اشریشیا کلی، باسیلوس سوبتیلیس، بوردتال پرتوزیس از نمونه سوآپ حلق و بینی، مایع مغزی-نخاعی، BAL، نمونه مایع چشمی، خلط و محیط کشت باکتریایی قابل استفاده می‌باشد.

بله. این روش برای استخراج ژنوم باکتری‌های گرم مثبت و مایکوباکتریوم‌ها که نیاز به انکوباسیون با آنزیم‌های خاص نظیر لیزوزیم یا لیزواستافین برای الیز دیواره سلولی سخت و چندلایه خود دارند، کارآمد می‌باشد. برای باکتری‌های گرم مثبت، مرحله پیش‌تیمار با آنزیم لیزوزیم یا لیزواستافین به مدت حداقل ۳۰ دقیقه در دمای ۳۷ درجه سانتی‌گراد در نظر گرفته شده است.

میزان DNA استخراج‌شده به نوع و حجم نمونه بستگی دارد. به عنوان مثال، از تعداد ۱ تا ۵×۱۰⁶ سلول یا کنیدی قارچی، حدود ۲۰ تا ۳۰ میکروگرم (µg) DNA ژنومیک قارچی قابل استحصال می‌باشد. DNA استخراج‌شده قابل برش توسط آنزیم‌های محدودکننده بوده و برای کاربردهای مولکولی نظیر PCR و Southern Blot مناسب می‌باشد.

ستون‌ها و تمامی بافرها در دمای اتاق (۱۸ تا ۲۵ درجه سانتی‌گراد) تا پایان تاریخ انقضا پایدار هستند. تأکید می‌شود که نگهداری بافرها در یخچال (۲-۸ درجه) یا فریزر (۱۵- تا ۲۵- درجه) به دلیل تشکیل رسوب، تأثیر منفی بر عملکرد کیت خواهد داشت. پروتئیناز K پس از آماده‌سازی باید در دمای ۲۰- درجه سانتی‌گراد نگهداری شود.

به ازای هر ویال ۸ میلی‌گرمی پروتئیناز K، مقدار ۳۰۰ میکرولیتر از بافر PK اضافه شده و به مدت ۲۰ ثانیه به خوبی ورتکس می‌گردد. آنزیم پروتئیناز K پس از آماده‌سازی، آماده مصرف می‌باشد و باید در دمای ۲۰- درجه سانتی‌گراد نگهداری شود. سایر بافرهای این کیت آماده مصرف می‌باشند.

برای خون محیطی، حداقل حجم نمونه ۳ میلی‌لیتر می‌باشد. نمونه‌های خون کمتر از ۳ میلی‌لیتر تا ۷۰٪ و نمونه‌های کمتر از ۲ میلی‌لیتر تا ۹۰٪ بازده استخراج را کاهش می‌دهند. برای نمونه BAL نیز حداقل حجم ۱۰ میلی‌لیتر توصیه شده است و نمونه‌های کمتر از ۱۰ میلی‌لیتر تا ۷۰٪ بازده استخراج را پایین می‌آورند.

حجم استاندارد بافر EB برای الوشن، ۵۰ میکرولیتر می‌باشد. افزایش زمان انکوباسیون با بافر EB بیش از ۲۰ دقیقه (یا به صورت overnight) قبل از سانتریفیوژ، به طور کلی باعث افزایش میزان استخراج DNA می‌شود. در صورت انکوباسیون overnight، جهت جلوگیری از تبخیر بافر EB، درب تیوب باید کاملاً با پارافیلم پوشانده شود. استفاده از حجم کمتر از ۵۰ میکرولیتر بافر EB باعث افزایش غلظت DNA در مایع عبوری می‌شود، اما میزان کل DNA استخراج‌شده را اندکی کاهش می‌دهد.

دلایل اصلی کاهش غلظت و راهکارهای مربوطه عبارتند از:

• کافی نبودن نمونه: استفاده از حجم نمونه بیشتر مطابق دستورالعمل

• الیز نامناسب: افزایش زمان انکوباسیون با بافر FL در دمای ۶۵ درجه تا ۳ ساعت

• عبور نکردن کامل محلول از ستون: افزایش زمان یا سرعت سانتریفیوژ و حذف رسوب قبل از انتقال به ستون

• عملکرد نامناسب پروتئیناز K: اطمینان از نگهداری در دمای ۲۰- درجه و آماده‌سازی مجدد

DNA استخراج‌شده با این کیت از کیفیت بالایی برخوردار بوده، قابل برش توسط آنزیم‌های محدودکننده می‌باشد و برای کاربردهای مولکولی نظیر واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR)، Southern Blot و سایر آزمایش‌های تشخیصی مولکولی مناسب است.

فرایند استخراج DNA قارچ و باکتری در مراحل اولیه تا حد زیادی مشابه است، اما تفاوت‌های زیر وجود دارد:

• برای قارچ: نمونه پس از آماده‌سازی، با پروتئیناز K در دمای ۵۶ درجه به مدت ۱ ساعت و سپس با بافر FL در دمای ۶۵ درجه به مدت ۱ تا ۳ ساعت انکوبه می‌شود.

• برای باکتری: نمونه پس از آماده‌سازی، با پروتئیناز K در دمای ۵۶ درجه به مدت ۱ تا ۳ ساعت و سپس با بافر FL در دمای ۶۵ درجه به مدت ۱ ساعت انکوبه می‌شود.

• برای باکتری‌های گرم مثبت: پیش‌تیمار با آنزیم لیزوزیم یا لیزواستافین به مدت حداقل ۳۰ دقیقه در دمای ۳۷ درجه انجام شده و سپس مرحله انکوباسیون با پروتئیناز K و بافر FL به ترتیب در دماهای ۵۶ درجه (۱ تا ۳ ساعت) و ۸۵ درجه (۱۵ دقیقه) انجام می‌شود.