این کیت به‌طور ویژه برای استخراج DNA ژنومیک از نمونه خون کامل (تازه) با بازدهی بالا طراحی و بهینه‌سازی شده است. DNA استخراج‌شده با این کیت تا مقدار ۷۰ میکروگرم و غلظت تا ۱۰۰۰ نانوگرم بر میکرولیتر قابل دستیابی بوده و به دلیل غلظت بالا، برای کاربردهای مولکولی نظیر PCR، Southern Blot و به ویژه تست‌های تایپینگ HLA که نیازمند مقدار بالایی از DNA می‌باشند، مناسب است.

از هر ۱ میلی‌لیتر خون کامل با شمارش لکوسیتی نرمال، بازده نهایی DNA معادل ۲۰ تا ۵۰ میکروگرم (µg) با نسبت جذب A260/A280 در محدوده ۱.۸ تا ۱.۹ (نشان‌دهنده خلوص بالا) قابل استحصال می‌باشد. این کیت قابلیت استخراج DNA با غلظت تا ۱۰۰۰ نانوگرم بر میکرولیتر را دارا می‌باشد.

ستون‌ها و تمامی بافرها در دمای اتاق (۱۸ تا ۲۵ درجه سانتی‌گراد) تا پایان تاریخ انقضا پایدار هستند. تأکید می‌شود که نگهداری بافرها در یخچال (۲-۸ درجه) یا فریزر (۱۵- تا ۲۵- درجه) به دلیل تشکیل رسوب، تأثیر منفی بر عملکرد کیت خواهد داشت. پروتئیناز K پس از آماده‌سازی باید در دمای ۲۰- درجه سانتی‌گراد نگهداری شود.

• پروتئیناز K: به ازای هر ویال ۴ میلی‌گرمی، مقدار ۲۰۰ میکرولیتر از بافر PK اضافه شده و به مدت ۲۰ ثانیه ورتکس می‌گردد. آنزیم پس از آماده‌سازی باید در دمای ۲۰- درجه سانتی‌گراد نگهداری شود.

• بافر RC: این بافر به صورت ۱۰× در کیت ارائه شده است. برای تهیه بافر ۱×، به ازای هر ۱ میلی‌لیتر از بافر RC ۱۰×، مقدار ۹ میلی‌لیتر آب مقطر سترون اضافه می‌گردد.

سایر بافرهای این کیت آماده مصرف می‌باشند.

حجم استاندارد خون قابل استفاده در این کیت از ۵۰۰ میکرولیتر تا ۲ میلی‌لیتر می‌باشد. برای حجم ۵۰۰ میکرولیتر خون، از میکروتیوب استفاده شده و فرایند در همان تیوب انجام می‌شود. برای حجم ۱ تا ۲ میلی‌لیتر خون، از فالکون استفاده شده و پس از مراحل اولیه، نمونه به میکروتیوب منتقل می‌گردد. استفاده از مقادیر بیشتر از میزان توصیه‌شده باعث مهار واکنش‌ها و کاهش غلظت DNA می‌شود.

بله. این روش برای استخراج DNA از نمونه‌های خون با شمارش لوکوسیت پایین (۱۰۰۰ تا ۳۰۰۰ سلول در هر میکرولیتر) با استفاده از مقدار ۲ میلی‌لیتر خون نیز مناسب می‌باشد. همچنین در صورت در دسترس بودن بافی‌کوت، می‌توان از آن برای افزایش بازده استخراج استفاده نمود.

حجم بافر EB قابل استفاده در مرحله الوشن بین ۷۰ تا ۱۴۰ میکرولیتر می‌باشد. استفاده از حجم کمتر از ۷۰ میکرولیتر باعث افزایش غلظت DNA در مایع عبوری می‌شود، اما میزان کل DNA استخراج‌شده را اندکی کاهش می‌دهد. توصیه می‌شود بافر EB قبل از استفاده در دمای ۶۰ درجه سانتی‌گراد گرم شده و ستون به مدت ۵ دقیقه در دمای اتاق انکوبه گردد.

بله. راهکارهای زیر باعث افزایش بازده استخراج DNA می‌شود:

• افزایش زمان انکوباسیون با بافر EB بیش از ۵ دقیقه قبل از سانتریفیوژ

• انکوبه کردن ستون با درب بسته در دمای ۶۰ درجه سانتی‌گراد

• تکرار مرحله الوشن با بافر EB رد شده از ستون برای بار دوم که باعث افزایش ۲۰ تا ۵۰ درصدی میزان DNA استخراجی می‌گردد

برای آماده‌سازی نمونه خون، ابتدا به ازای هر حجم خون، سه برابر آن بافر RC ۱× اضافه شده و به مدت ۵ دقیقه در دمای محیط انکوبه می‌گردد. سپس نمونه با سرعت ۳۰۰۰×g به مدت ۳ دقیقه سانتریفیوژ شده و مایع رویی (شامل گلبول‌های قرمز تخریب‌شده) بدون آسیب به رسوب سلولی (گلبول‌های سفید) دور ریخته می‌شود. در ادامه، رسوب سلولی برای فرایند استخراج آماده می‌گردد.

دلایل اصلی کاهش غلظت و راهکارهای مربوطه عبارتند از:

• کافی نبودن نمونه: برای نمونه‌های خون کم‌لوکوسیت از بافی‌کوت استفاده شود.

• الیز نامناسب: رعایت زمان انکوباسیون ۱۰ دقیقه با بافر G1 در دمای ۵۶ درجه و مخلوط کردن کامل نمونه با ورتکس

• نگهداری نمونه در شرایط نامناسب: خودداری از استفاده از نمونه‌های با چرخه انجماد-ذوب مکرر و نمونه‌های نگهداری شده طولانی‌مدت

• عبور نکردن کامل محلول از ستون: افزایش زمان یا سرعت سانتریفیوژ و حذف رسوب قبل از انتقال به ستون

• عملکرد نامناسب پروتئیناز K: اطمینان از نگهداری در دمای ۲۰- درجه و آماده‌سازی مجدد

• مسدود شدن غشاء ستون: خودداری از استفاده از بافرهای دارای رسوب و رعایت حجم مجاز نمونه