قبل از ظهور تکنیک های مدرن، جداسازی و خالصسازی اسید نوکلئیک یک روش پرزحمت ، زمانبر و با مراحل استخراج و سانتریفیوژ متعدد بود که اغلب به دلیل بازدهی کم و خلوص پایین محصولات محدود میشد و برای استفاده اتوماتیک و در مقیاس بزرگ مناسب نبود. با این حال، در طی چند سال گذشته ذرات مغناطیسی عامل دار توسعه یافته اند که همراه با یک سیستم بافری مناسب امکان خالص سازی سریع و کارآمد را مستقیماً پس از استخراج آنها از عصاره های سلولی خام می دهد.
تخلیص مغناطیسی DNA روشی ساده و قابل اعتماد برای استخراج DNA است.
جداسازی DNA چگونه انجام می شود؟
در مقایسه با روش های ایمونولوژیک، تشخیص اسید نوکلئیک یک روش مستقیم با حساسیت بالاتر است و زمان کمتری برای آماده سازی کیت ها نیاز دارد. روشهای بیشماری «بدون تکثیر » و «مبتنی بر تکثیر» برای تشخیص اسید نوکلئیک وجود دارد، با این حال، حساسیت تشخیص اسید نوکلئیک پس از تکثیر افزایش مییابد. مراحل اصلی در تمام استخراج اسید نوکلئیک شامل لیز سلولی (یا تخریب سلولی)، غیرفعال کردن نوکلئازهای سلولی، حذف پروتئین و آلایندهها و استخراج/تصفیه اسید نوکلئیک است.
تخریب سلول ها یک فرآیند مکانیکی است: بافت معمولاً در نیتروژن مایع منجمد و خرد می شود تا ساختار ماکروسکوپی شکسته و دیواره های سلولی پاره شوند. سپس این مخلوط بافت، با حلالها و نمکها مخلوط میشود تا پروتئینهای ناخواسته شسته شود، آنزیم DNAses غیرفعال گردد و DNA در محلول قابل استفاده جمعآوری شود. در نهایت، حلال آلی فنل-کلروفرم برای تغلیظ DNA در فاز آبدوست استفاده می شود. سپس این محلول آبدوست را می توان جمع آوری و سانتریفیوژ کرد و سپس تا زمانی که DNA خالص بازیابی شود، شستشو داده می شود.
روشهای قبلی شامل جمعآوری DNA به صورت رسوب در انتهای لوله بود که سپس در آب حل و جمعآوری میشد. برای افزایش بازده و ساده کردن پروتکلهای بین آزمایشگاهها، سیستمهای پشتیبانی فاز جامد توسعه یافتند. در حال حاضر، کیت های تجاری با استفاده از ترکیبی از حلال ها و ستون های پشتیبان فاز جامد به طور گسترده ای برای جداسازی و خالص سازی DNA و RNA استفاده می شوند.
جداسازی مغناطیسی
بیدهای مغناطیسی مجموعه ای از ذره های همسان (قطرnm -50mm 500) هستند که معمولا از کامپوزیت های تشکیل شده از نانوذره های مغناطیسی تشکیل شده اند. هنگامی که این ذره ها در معرض میدان مغناطیسی قرار می گیرند، یک جریان مغناطیسی دارند که می توانند با استفاده از آن پس از اتصال به اسید نوکلئیک و مرحله الوت کردن با حذف حلال های دیگر، DNA خالص و آماده جهت اندازه گیری و تجزیه و تحلیل را جمع آوری کرد.
حامل های مغناطیسی با لیگاند های میل ترکیبی تثبیت شده و یا تهیه شده از یک پلیمر با میل ترکیبی به سمت نوکلئیک اسید هدف، جهت فرایند خالص سازی استفاده می شوند. چنین موادی ذرات مغناطیسی هستند که از پلیمرهای مصنوعی مختلف، پلیمرهای زیستی، شیشه متخلخل یا ذرات مغناطیسی بر پایه مواد مغناطیسی معدنی مانند اکسیدآهن اصلاح شده. حامل های مغناطیسی مختلفی به بازار عرضه شده است.
استخراج DNA توسط بیدهای مغناطیسی چگونه انجام می شود؟
در تکنیک جداسازی مغناطیسی اولیه از ذرات متشکل از یک هسته اکسید آهن پوشیده شده با سیلان استفاده می کردند. سطح پوششی ذرات به مولکول های حاوی کربوکسیلیک اسیدآزاد متصل است که به نوبه خود به DNA و RNA متصل می شود. غلظت نمک تعیین کننده میزان قوی بودن این پیوند است که امکان پیوند برگشت پذیر را فراهم می کند. در غلظت صحیح نمک، اسیدهای نوکلئیک به ذرات مغناطیسی متصل می شوند.
ذرات پارامغناطیسی مناسب هستند زیرا در غیاب میدان مغناطیسی با یکدیگر برهم کنش ندارند. این ذرات تحت یک میدان مغناطیسی قوی مغناطیسی می شوند، اما پس از حذف میدان مغناطیسی بصورت دائم مغناطیسی نمی مانند. هنگامی که از تجمع ذرات مغناطیسی در طول واکنش جلوگیری شود، معلق شدن یکنواخت ذرات و استخراج اسیدهای نوکلئیک به صورت قطع انجام می پذیرد. ماده یا موادهایی با سطح پوششی بزرگ جهت اتصال اسیدهای نوکلئیک ترجیح داده می شود. فرایند اتصال اسیدهای نوکلئیک ممکن است بصورت پیچشی باشد که عموما سطحی نامنظم دارند و یا ممکن است متخلخل باشند برای مثال ذرات معلق به ویژه ذرات پلیمری که به دلیل بزرگ تر بودن ترجیه داده می شوند. به آسانی یک تکیه گاه ذرات جامد در بیدهای کروی استفاده شده است. ذرات monodisperse (ذراتی که عمدتا دارای شکل و سایز یکنواخت هستند) این مزیت را دارند که قابلیت تکرارپذیری بسیار یکنواخت جداسازی مغناطیسی را فراهم می کنند.
چگونه از ذرات مغناطیسی جهت استخراج DNA استفاده می شود؟
ذرات مغناطیسی از سنتز پلیمرهای تعبیه شده با رنگدانه اکسید آهن و یا هسته های فلزی اکسید آهن که پوشیده شده جهت فعال شدن است ساخته شده اند. این ذرات همسان را می توان با بخش های کاربردی پوشاند و یا بدون پوشش رها کرد. بعضی از عملکردهای پوششی با برهم کنش الکتروستاتیکی( بخش های با بار مثبت مانند آمین ها و ایمیدازول) کار می کنند. در حالیکه برخی دیگر از طریق برهم کنش واسطه های مانند نمک یا PH(سیلیکا و گروه های کربوکسیلی) کار می کنند. استخراج DNA اختصاصی تر یا (RNA) با معرفی اولیگونوکلئوتیدهای هدف به سطح بیدهای مغناطیسی صورت می گیرد. این اولیگونوکلئوتیدهای هدف در استخراج توالی های اختصاصی از ssDNA یا RNA بسیار پرکاربرد میباشند.
نمونه هایی از استخراج DNA به وسیله بیدهای مغناطیسی
از بیدهای مغناطیسی در طیف گسترده ای از استخراج DNA در زمینه های مختلف استفاده می شود شامل:
استخراج DNA پلازمید
از بیدهای مغناطیسی برای استخراج DNA پلازمید از نمونه اولیه یا خام استفاده می شود. این فرایند با جداسازی DNA پلازمید از DNA ژنومیک و پروتئین ها، قبل از اتصال DNAپلازمید به بیدهای مغناطیسی و قرار گرفتن در میدان مغناطیسی صورت می گیرد.
استخراج قطعه های DNA
کیت های بسیاری جهت استخراج DNA از جمله قطعه هایی از DNA وجود دارد. DNA های قطعه ای ممکن است در NGS نیاز باشد. قطعه ها را می توان توسط بیدهای مغناطیسی که می توانند اندازه یک مولکول را انتخاب کنند جدا کرد.
پیشرفت بیدهای مغناطیسی جهت استخراج DNA
بیدهای مغناطیسی روشی سریع،ساده و کارآمد برای جداسازی DNA نسبت به تکنیک های قدیمی و سنتی ارائه می دهد. در روش قدیم با ایجاد نیروهای برشی باعث تخریب اسیدهای نوکلئیک و ایجاد آلودگی می شدند و یا اجزایی از سلول های لایز شده مانند DNA پلیمراز، ترکیبات فنلی یا مواد هیومیک را نیز استخراج می کنند که این ها واکنش PCR را مهار می کند.
DNA را می توان بصورت مستقیم از نمونه های اولیه مانند خون، بافت،محیط های کشت و … استخراج کرد. ذره های نانو در واکنش هایی استفاده می شوند که در آن ها محدودیت هایی با توجه به حجم نمونه وجود ندارد. با توجه به امکان تنظیم خواص های مغناطیسی مواد جامد می توان به راحتی از نمونه های سوسپانسیون ویسکوزیته و حجم های کم انتخاب و جدا کرد.
جداسازی مغناطیسی تنها روش امکان پذیر برای بازیابی ذرات کوچک ( قطر تقریبا 1-0.05 میکرومتر) در حضور باقی مانده های سلولی و سایر رسوب دهنده با اندازه مشابه است. جداسازی مغناطیسی به ویژه برای استخراج مقیاس های بزرگ تر مناسب است.
این تکنیک ها همچنین بعنوان پایه ای از روش های خودکار مختلف عمل می کنند که باعث صرفه جویی در زمان و هزینه بدون استفاده از ستون می شود. انواع مختلف ذره های مغناطیسی بصورت تجاری برای استخراج نوکلیک اسید به روش دستی و خودکار پیشنهاد می شود.
